传统的光学显微镜受光的衍射效应和光学系统有效孔径的限制，存在分辨极限δ（也称 阿贝极限），即δ＝0.61λ/(nsinα)，其中，λ为光源的波长，ｎ为折射率，α为孔径角。假设光源的波长λ为 400 nm，物镜和样本之间的介质为空气（折射率ｎ＝１），此时的分辨率为 200 nm。

这样的分辨率水平对于平均直径为 10~20 μｍ的人体细胞来讲是足够了，但是对于亚细胞结构，如线粒体、中心体、高尔基体、细胞骨架等，还远远不够。这意味着它无法清晰地观察小于该尺寸的生物结构，如膜蛋白、转运蛋白和核糖体等。

超分辨显微成像技术应运而生，通过各种手段绕过这一限制，实现了分辨率的显著提升。

超分辨光学显微的成像原理主要分为两类：一类是基于单分子定位显微（SMLM）成像，它包括光激活定位显微（PALM）和随机光学重构显微（STORM）；另一类是基于点扩散函数（PSF）调制的超分辨显微成像，它包括受激发射损耗显微（STED）和结构光照明显微（SIM）。

PALM是一种基于单分子定位的超分辨技术，通过使用光激活荧光蛋白（如 PA-GFP）来实现荧光分子的开关控制。在每次成像循环中，只激活一部分荧光分子，使其短暂发光，然后通过高斯拟合定位其位置，最后将所有位置信息叠加，形成超分辨图像。

PALM的优势在于其能够实现高精度的单分子定位，分辨率可达 10-30 nm，适合观察分子级别的结构，如蛋白质复合物和细胞骨架，适合用于研究分子动力学和相互作用。然而，PALM对荧光分子的光稳定性要求较高，且需要较长的成像时间，不适合长时间活细胞成像。STORM是另一种基于单分子定位的超分辨技术，与PALM类似，但使用的是合成的光转换荧光染料（如 Alexa Fluor 647）而非光激活荧光蛋白。STORM通过随机激活荧光分子，并通过高斯拟合定位其位置，最终重建出超分辨图像。STORM的分辨率同样可达 10-30 nm，适合观察分子级别的结构。但是由于SMLM不断重复采集定位的原理，其在时间分辨率上天然受限，通常需要数十分钟。

STED的核心原理是利用非线性光学效应，通过受激辐射损耗抑制外围的荧光分子，使得只有焦点中心的荧光分子能够发出信号，从而提高分辨率。

STED技术的基本原理是使用两束激光进行成像：一束激光（称为“铅笔光”）用于激发荧光分子，使其处于激发态；另一束激光（称为“橡皮光”或“STED光”）具有特定的波长和空间分布，通常呈“甜甜圈”形状，其中心强度为零。

STED光的作用是将激发态的荧光分子通过受激发射的方式返回基态，从而抑制其发光。由于STED光的中心区域强度为零，只有位于该区域的荧光分子能够不受抑制地发光，从而实现超分辨率成像。

STED的横向分辨率为 20-50 nm，轴向分辨率为 50-100 nm，适用于观察中等分辨率的细胞结构，如细胞器和囊泡。STED的优势在于其成像速度快，尤其在小视场下可以实现视频速率成像，适合对小区域进行实时观察。

然而，STED对样品的制备要求较高，需要使用特定的荧光染料，并且对激光器的稳定性有较高要求。

图2. STED显微成像原理示意图（a）STED中用到的受激辐射过程；（b）光路示意图；（c）STED超分辨原理

SIM技术的基本原理是基于莫尔条纹（Moiré pattern）效应。当两个空间频率相近的周期性光栅图形叠加时，会产生一个低频的干涉条纹，即莫尔条纹。这种条纹的频率低于原始光栅的频率，因此可以被光学系统有效探测。

通过这种方式，SIM能够将样品中原本无法被传统显微镜分辨的高频信息（如亚细胞结构）调制到低频区域。换句话说，莫尔条纹编码了原本无法被光学系统直接采集的高频信息。

通过移动和旋转照明图案，使多个角度和位置的图案覆盖样品的各个区域，并对拍摄的多幅图像进行处理和重建，就可以得到该样品的超分辨率图像。这种技术不仅提高了成像分辨率，还保持了宽场显微成像的高速度和大视场优势。

SIM的成像速度较快，适合活细胞成像，但相比单分子定位技术（如PALM、STED）等，其分辨率和成像速度仍有提升空间。

SIM的分辨率通常在横向 100-130 nm，轴向 300-400 nm，适用于观察细胞结构和动态过程，如细胞器、线粒体等。SIM与传统光学显微镜兼容性好，且无需特殊荧光标记，光毒性低，光漂白少，适用于活细胞动态成像、多色成像和三维成像等应用。

图4. SIM分辨率增强原理（a）具有细节特征的样品；（b）结构光照明模；（c）由图3(b）和图3(a）叠加形成的叠栅条纹；（d）SIM的傅里叶空间变换

超分辨显微成像技术通过多种技术手段突破了传统光学衍射极限，实现了更高分辨率的成像。研究者可根据具体需求选择合适的技术：

[1] M. Moreau, P. Cochard. “[Nobel Prize in Chemistry 2014 - from microscopy to nanoscopy: a revolution in resolution]..” Medecine sciences : M/S[2014-12-01]

[2] HUANG B, BATES M, ZHUANG X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy[J].Annual Review of Biochemistry, 2009, 78(1): 993 –1016.

[3] 付芸,王天乐,赵森.超分辨光学显微的成像原理及应用进展[J].激光与光电子学进展,2019,56(24):21-33.