生物化学和基因工程的最新进展证明可利用光来控制细胞的激活和抑制，这使我们能够分析完整神经网络中的神经元群体。目前使用单光子宽场照明的方法得到广泛的应用和认可。然而，由于光学切片难度和光散射引起的低穿透深度，使得单光子成像技术受到限制。例如，单光子荧光成像很难做到穿透大脑表层组织直接观测其下层小部分基因相同的相互连接的细胞行为。

相比于单光子显微成像技术，非线性多光子激发过程中具备固有的抑制光散射效应优势，同时还提供了优越的轴向分辨率。在多光子荧光显微成像技术中，宽场激发可以通过快速扫描具有光学衍射受限的光斑产生。在这种情况下，由于使用具有衍射极限的光斑扫描从而保持了轴向分辨率；然而，这将直接导致在宽场成像上时间分辨率的快速丧失。同时，对于深层成像，激光扫描显微成像的方法依然存在明显的光散射现象，导致其光激发效果明显降低和成像畸变现象产生。

自适应光学提供了一种改善光散射的方法：利用自适应波前整形，在散射介质内部重新生成衍射极限的光激发。但是自适应光学过程较慢，实用型较差。近几年，超短脉冲激光的时域聚焦（Temporal Focusing）被认为是有效产生高轴向分辨率、宽场多光子激发模式的一种方法。在时聚焦中，使用无色散望远镜将所需的激发光从衍射光栅的表面成像到样品上。由衍射光栅和望远系统控制的空间几何色散在光传播方向上限制了样品中的多光子激发，该过程与激发光的形貌无关。然而，在目前的这些应用中，时聚焦很难达到近衍射极限分辨率，并且在保证轴向分辨率同时将牺牲宽场成像区域或时分辨率。另外对激光单脉冲能量要求高，从而大大提升了显微镜成本。

在这里，我们探讨一种时空聚焦（Spatiotemporal Focusing）多光子荧光显微成像技术，使用低成本的高重复频率飞秒激光器。通过将时聚焦和空聚焦在正交方向相结合，我们可以运用激光腔内光谱调谐技术做到宽场快速成像。同时，可将轴向分辨率达到近衍射极限，另外使用一种简易波前整形技术做到宽场均匀光激发。实验中，在小鼠肺部和蜗牛局部组织预定1 mm深的内部散射样品中，可以达到3.5 μm的轴向分辨率和毫秒级时间分辨率。

在该时空聚焦多光子荧光显微成像系统（如图1所示）中，我们使用一台中心波长800 nm、重复频率80 MHz、脉宽150 fs（带宽6.9 nm）、单脉冲能量36 nJ的飞秒激光器，飞秒激光光谱带宽可由计算机控制调节，通过控制腔内色散棱镜对的相对位置和间距以及狭缝尺寸可将带宽渐进调谐至21.4 nm。输出激光通过半波片和光隔离器来控制输出光强和保护激光器，光束经扩束后通过空间光调制器和柱透镜对实现波前整形，一维振镜在y轴方向扫描激光光束，柱透镜将光束聚焦至光栅表面，透镜将色散光束汇聚至显微物镜通光孔径处并将在光栅面上的光束重构至物镜后焦面上。样品出射荧光经二向色镜和筒镜后在CCD相机上成像。

图1.时空聚焦多光子荧光显微镜结构示意图。

首先讨论一下光激发与光束形状的关系。在时空聚焦中，飞秒激光沿x轴和y轴方向分别为时聚焦和空聚焦，在物镜通光孔径处沿x轴方向为经光栅色散后飞秒激光不同频率光分布的彩虹光束，每频率成分光束沿y轴方向为准直光束。光束各频率成份传输至物镜后端将沿轴向逐渐重合并重新生成飞秒激光（在扩束镜前一对色散棱镜对需要提前对脉冲激光进行预压缩，从而使得飞秒激光各频率成份可同时到达物镜的后焦面）。沿x轴方向的彩虹光束的尺寸主要由飞秒激光带宽、衍射光栅空间周期和透镜的焦距决定，在系统确定后彩虹光束尺寸也即确定，其在物镜后方完全重合的位置为时焦面（Temporal Focusing Plane，TFP）；y轴方向平行光束的尺寸由柱透镜和透镜的焦距决定，其焦面为空焦面（Spatial Focusing Plane，SFP）。当x轴和y轴方向的光束尺寸不同时将会产生明显的焦移现象，如图2所示，时焦面和空焦面存在位置差Δxy。当光束沿x、y方向均完全填充，时聚焦和空聚焦将在物镜后焦面重合并达到最终效果。图2(B)中给出当物镜沿y轴完全填充，x轴彩虹光束尺寸变化与聚焦光束的位置变化关系。

图2.(A)时空聚焦效果图，(B)时聚焦和空聚焦与光束填充因子关系。

图3将展示我们搭建的时空聚焦多光子荧光显微镜和商业激光扫描多光子荧光显微镜的成像效果对比图。样品为高散射intralipid，0.5 μm的荧光小球通过琼脂糖凝胶固定在intralipid中；通过10X，数值孔径0.45的物镜，使用两种不同显微成像方法观测荧光小球的截面，如图3(A)所示，可发现在高光散射样品中，激光扫描成像很容易发生成像畸变，而时空聚焦方法可在保持高轴向分辨率同时可有效擦除成像畸变。将这两种方法再次用到小鼠肺部成像中，并对其xz截面成像并行分析，可以发现时空聚焦多光子荧光显微成像可以相比激光扫描方法达到更好的轴向分辨率，另外可以做到更好的各向分辨率同等的效果，如图3(B)所示。图4给出了在蜗牛脑部的部分区域三维成像。

图3.使用时空聚焦和激光扫描两种方式分别在（A）掺杂高散射的荧光小球样品和（B）小鼠肺部三维成像。

图4.蜗牛部分组织三维成像。

我们的论证表明，保证有效的孔径对称性可以使时空聚焦多光子荧光显微镜的轴向分辨率达到近衍射极限，同时擦除三维成像中出现的成像畸变。实验中所使用的激发光源为较低单脉冲能量飞秒激光，其光谱腔内调谐方法可以使得多光子荧光显微成像在保证空间分辨率、宽场成像的同时达到毫秒级的时间分辨率。实验中使用10倍，数值孔径0.45的物镜，在小鼠肺切片和蜗牛组织结构内（780 μm×780 μm×900 μm）进行三维成像来测试该系统的成像性能。