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基于多光子上转化材料和时间编码结构光显微镜的高速超分辨成像系统 (MUTE-SIM)

发布时间：2020-04-26 14:25:59 阅读次数：1499

导读

多光子显微镜因拥有较深的成像深度，和较高的对比度在生物成像中有着重要的意义，但是它通常需要较高的功率。结合时间上展开的超短脉冲可以实现超快的扫描速度和较深的成像深度，但是其本身所利用的近红外波段的光会导致分辨率较低。清华大学陈宏伟教授和北京大学席鹏研究员合作研究，结合了结构光成像和上转化粒子，开发了一种基于多光子上转化材料和时间编码结构光显微镜的高速超分辨成像系统(MUTE-SIM)。它可以实现50 MHz的超高的扫描速度，并突破了衍射极限，实现了超分辨成像。相较于普通的荧光显微镜，该显微镜提升了223.3%的分辨率，并且只需要较低的激发功率。这种超快、低功率、多光子的超分辨技术，在高分辨生物深层组织成像上有着长远的应用前景。相关成果以“MUTE-SIM:multiphoton up-conversion time-encoded structured illumination microscopy”发表在期刊 OSA Continuum 上。

作者简介

共同一作：

胡成洋，清华大学电子工程系博士生。

吴朝阳，北京大学工学院生物医学工程系博士生。

共同通讯作者：

陈宏伟，清华大学电子工程系教授，博士生导师，青年长江学者，国家优青，中组部青年拔尖人才。中国激光期刊编委，Journal of Lightwave Technology客座编辑。研究方向：微波光子学、光信号处理、高速激光成像及交叉学科应用。发表学术论文100余篇，SCI引用超过600次，授权发明专利12项。包括Nature子刊在内的多个知名学术期刊审稿人。

席鹏副教授，北京大学工学院研究员。致力于光学超分辨成像技术的研究，发展了一系列新型超分辨技术。2015年当选美国光学学会资深会员，和中国光学学会生物医学光学分会常务委员。在Nature、Nature Methods等国际一流期刊发表SCI收录期刊论文60余篇。2016年获得中国光学重要成果奖，2018年获得北京市杰出青年科学基金。已授权美国专利3项，中国专利8项，编辑专著2部。多次被OSA和SPIE组织的国际会议邀请作大会邀请报告。

研究背景

在生物成像中，我们基本都在追求：清（清晰），快（快速），深（深层），活（活体）这四个方面。在许多的生物学应用中，获取清晰高分辨率的图像一直是一项永远的追求。激光扫描显微镜一直以来有着广泛的应用，但是因其扫描速度较慢，在动态成像方面受到了一定的限制。利用对时间上展开的脉冲光进行空间上色散的方法，Goda等研制出了一种新型的激光扫描显微镜，而这种显微镜的扫描速度是普通激光扫描显微镜的1000倍。这种技术需要利用近红外光，有利于深层成像，但是也由于波长大，会导致分辨率下降。利用多光子技术产生短波长的荧光可以提高分辨率。但是多光子常常会受到高光功率和光漂白的影响，不利于长时间生物成像。考虑到上转化粒子(UCNPs)有着高抗漂白，大斯托克斯位移等优势，本研究采用了UCNPs材料来减少多光子显微镜对光强等的高要求。尽管多光子技术可以提高分辨率，但是其仍然受限于衍射极限。本研究结合了结构光超分辨显微镜技术(SIM)，进一步将分辨率提高，突破衍射极限实现超分辨。

研究内容

研究方法和材料

为了实现超快的扫描速度，本研究利用了时间编码产生结构光的方法。同时本研究中所利用的新型材料是β-NaYF4:25%Er3+@NaYF4上转化纳米粒子。

时间编码结构光的产生

时间编码的空间结构光的产生如图1所示，主要分为两个步骤：（1）时间域到光谱域的转化；（2）光谱域到空间域的变化。

图1.时间编码结构光的产生原理图。(a-c)脉冲光在时间域、光谱域、空间域的对应关系；(d)脉冲光通过色散光纤在时间上展开；(f)对应于(d)，时间上展开的脉冲光经过光栅后在空间上也展开了；(g)利用波形发生器和高宽带光学调幅器对展开的脉冲光进行时间上的编码；(h)对应于(g)在光谱上的编码；(i)对应于(g)和(h)，时间编码反映在空间上的明暗交替的结构光。

在第一步中，首先时间域的脉冲光经过色散光纤后在时间上散开，如图1(d)所示，然后利用高宽带光学调幅器进行调制，对其进行编码。这种编码结果同时导致了其在光谱域的明暗调制。

在第二步中，将该脉冲光通过一个光栅，使得其在空间上散开。因为光栅可以将光谱上的对应关系投射在空间上，所以可以看到如图1(i)所示的空间上编码的明暗条纹。

一旦获得了等间距的明暗条纹，就可以利用它来进行结构光超分辨成像，来实现超分辨。

荧光材料

本研究采用的是新型材料是β-NaYF4:25%Er3+@NaYF4上转化纳米粒子。如图2(a)所示，它有5个荧光发射峰：379、408、525、540和660 nm，对应图2(d)的能级关系。由图2(b)和2(c)所示的透射电子显微镜下的成像图和粒子直径统计图可以看出，粒径平均值在22 nm左右。

图2.新型材料β-NaYF4:25%Er3+@NaYF4的性质。(a)在25 mW光强1560 nm波长的光激发下所展示的荧光发射峰：379、408、525、540和660 nm；(b，c)该材料在透射电子显微镜下的照片，粒子直径约22 nm；(d) 该材料的能级图。

实验装置的原理图

图3.实验装置原理。

图3所显示的是本研究实验装置的原理图。激光器首先经过色散光纤和光学调幅器进行时间域和光谱域的编码，再经过一个光栅在空间上进行色散。通过两个透镜进行扩束的同时，将色散后的光搬移到物镜后焦面处，经过物镜照射到样本上。返回的荧光，经过物镜的收集，通过二向色镜，滤波片，镜筒透镜，汇聚到科研相机EMCCD上。

实验结果

在结构光超分辨显微镜中，结构光明暗条纹的宽度变化直接影响图像的分辨率，结构光的相位变化能力保证了该超分辨方法能够顺利实施。在实验结果部分，首先展示了本文的实验装置对结构光宽度和结构光相位的调节能力。最后，进行了图像采集和超分辨重建，并实现了223.3%的分辨率提升效果。

结构光明暗条纹的宽度调节

图4展示的是对结构光明暗条纹的宽度的调节能力，同时从实验上验证了时间域、光谱域、空间域上编码的对应关系。图4(a-c)展示了时间上，同一脉冲，在不同时间点的强弱经过调制以后得到的结果。当然当时间上的调制间隔越紧密，对应在光谱域图4(d-f)上也会更加紧密，最后，在空间域图4(g-i)上，其空间分布也就是明暗条纹的宽度也会更窄。图4(g-i)从左到右分别展示了8 μm、4 μm和2 μm的明暗条纹空间间隔能力，为进行高分辨的结构光成像打下基础。

图4.对结构光明暗条纹的宽度的调节能力。(a-c)时间上的脉冲宽度调节；(d-f)光谱上的强弱调节；(g-i)空间上明暗条纹的宽度调节。图从左到右分别对应8 μm、4 μm和2 μm。

结构光明暗条纹的相位调节

图5.明暗条纹的相位调节。(a)0相位时的明暗条纹；(b)π/2相位时的明暗条纹；(c)π相位时的明暗条纹；(d)沿着(a)、(b)、(c)中红线所示位置的强度变化图。

图5展示了相位在0，π/2，π之间变化时，图像条纹的变化，该结果显示该实验装置具有较好的相位调节能力，为结构光超分辨技术的实现打下了基础。

超分辨成像结果

对上转化粒子进行超分辨成像的结果如图6所示。图6(a)是传统的荧光显微镜图像。图6(c)是重建后的结构光超分辨图像(SIM图像)。从图6(f)和6(g)的分辨率结果中可以看到：SIM图像的半高宽FWHM在0.71 μm，而原始的多光子荧光图像半高宽FWHM在0.82 μm。这表明在多光子荧光显微镜的基础上对分辨率的提升达到了0.82/0.71=115.4%。根据衍射极限的公式，如果考虑1560 nm激发，而不使用上转化粒子，其衍射极限为FWHM=0.61λ/NA=1.586 μm(λ=1.56 μm，NA=0.6)。所以，结合上转化纳米粒子和时间编码的结构光超分辨成像，分辨率总共提升了1.586/0.71=223.3%。

图6.上转化粒子的多光子结构光超分辨成像结果。(a)显示了宽场下上转化粒子的成像图；(b)显示了(a)中红色箭头所示处的光强分布；(c)显示了上转化粒子结构光超分辨还原后的成像图；(d)显示了(c)中红色箭头所示处的光强分布；(e)是(a)中红框里的放大图；(f)是(e)中红线所示处的光强分布；(g)是(c)中红框里的放大图；(h)是(g)中红线所示处的光强分布；(a)、(c)、(e)、(g)图上的基准尺分别代表10 μm、10 μm、0.4 μm、0.4 μm。

研究总结

本文结合了多光子上转化材料以及时间编码的结构光超分辨技术，实现了快速（50MHz的扫描速度），超分辨（超衍射极限223.3%的分辨率）成像。作为一种新的高速，超高分辨率的成像系统，MUTE-SIM可以帮助我们对快速运动的生物图像进行超高分辨的成像。尽管关于深度成像的应用我们没有进一步展示，但是结合1560 nm近红外光相对于可见光更佳的穿透性，我们相信该技术将有利于对生物组织进行高速，超分辨，高深度地成像，有助于生物影像学的发展。

论文链接：

https://www.osapublishing.org/osac/abstract.cfm?uri=osac-3-3-594

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